Тайны и загадки "живого" света

Перейти в оглавление раздела:Поведение и окружающая среда

* Свечение организмов и эволюция

БИОСИНТЕЗ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

Успехи современной генной инженерии позволяют синтезировать в бактериальных клетках чужеродные им белки. Эта технология широко используется в научных исследованиях и для производства практически важных продуктов. Известно, что пространственная структура белка определяет его функциональную активность. Сворачивание белковой цепи, т.е. образование конечной пространственной структуры вновь синтезированного белка в клетках родительского организма, - процесс, во многом еще загадочный. Рассуждая логически, можно предположить, что организм каким-то образом "знает", какой должна быть пространственная конформация белка, чтобы он выполнял требуемые от него функции. Когда же мы искусственно переносим процесс синтеза белка, животного или растительного, в чужеродное окружение бактериальной клетки, обретение белком нужной конформации становится особенно важным. Но нередко синтезированный в микробной клетке белок не обладает правильной пространственной структурой и, следовательно, желаемыми свойствами, хотя его химический состав не отличается от природного.

При исследовании процесса биосинтеза люциферазы светляков в клетках E.coli мы обнаружили, что на начальной стадии белок синтезируется в каталитически неактивной форме. Его превращение в активный фермент требует значительного времени - до 50 - 70 ч. Не будучи самопроизвольным, этот процесс управляется особыми белками - шаперонами. Их функции весьма разнообразны, но основная их задача - контроль за правильностью сворачивания синтезируемых в клетке белков. И этот контроль шапероны осуществляют различными путями. Одни шапероны связываются с "неправильно" свернутыми или агрегированными белками, заставляя их развернуться и после этого вновь свернуться, но уже правильно. Другие шапероны образуют комплексы с синтезированным белком, который еще не приобрел конечной активной формы. Когда такой комплекс разрушается, высвобождается каталитически активный фермент.

Мы доказали, что именно такой механизм реализуется при биосинтезе люциферазы светляков в клетках E.coli благодаря наличию в них шаперона DnaK. В дефектных штаммах E.coli, где такой шаперон не синтезируется, образовавшийся белок люциферазы не превращается в каталитически активный фермент. Шапероны называют белками теплового шока, поскольку их синтез в клетках инициируется такими стрессовыми воздействиями, как резкое повышение температуры или рН среды. Для функционирования эти белки требуют участия АТФ (как источника необходимой энергии). Поэтому, когда мы подвергали клетки Е.сoli кратковременному тепловому шоку да еще вводили в них дополнительные количества АТФ, нам удавалось не только увеличить активность синтезированной люциферазы, но и в несколько раз ускорить ее сворачивание, а стало быть, заметно оптимизировать биосинтез фермента.

Аналоги шаперонов DnaK имеются не только в бактериальных, но и в животных клетках. Можно предположить, что и в организме самих светляков сворачивание белка люциферазы идет таким же образом.

ЛЮЦИФЕРАЗА - ФЕРМЕНТ-"САМОУБИЙЦА"?

В природе в сумеречное время светляки ярко светятся не один час подряд, подмигивая своими "лампочками" с частотой в несколько секунд. В пробирке же при смешении всех необходимых компонентов биолюминесцентной реакции видна яркая, но короткая вспышка света. Чем выше концентрации люциферина, АТФ и люциферазы в реакционной смеси, тем вспышка ярче. А затем наблюдается лишь слабое остаточное свечение, которое медленно затухает в течение нескольких часов. Само собой напрашивается объяснение, что быстрое затухание свечения связано с расходованием реагирующих веществ. Но в действительности после вспышки их концентрации в реакционной смеси достаточно высоки. Почему же реакция как бы останавливается, не доходя до конца?

Чтобы разрешить эту загадку, мы проанализировали (с помощью компьютерных программ) кинетику биолюминесцентной реакции при разном соотношении концентраций люциферазы, люциферина и АТФ. Выяснилось, что фермент инактивирует, теряет каталитическую активность, на всех стадиях ферментативного окисления люциферина. Постепенно инактивируют также и комплексы фермента с субстратами, промежуточным и конечным продуктами. Быстрее всего - в десятки раз по сравнению со свободным ферментом - теряет активность комплекс люциферазы с продуктом. Кроме того, этот комплекс настолько прочен, что при избытке субстратов после первого цикла реакции большая доля фермента так и остается полностью связанной, а значит, неактивной в последующих каталитических циклах.

Возникает вопрос, почему же этого не происходит в организме самих светляков? По-видимому, в их клетках присутствуют специальные вещества, которые защищают фермент от инактивации и способствуют разрушению комплекса фермент - продукт, т.е. регенерации активного биокатализатора. Действительно, мы обнаружили, что некоторые поверхностно-активные и природные вещества обладают такой способностью. Еще несколько лет назад было показано, что если добавить коэнзим А (один из природных коферментов, участвующий в реакциях окисления, синтеза жирных кислот и т.д.) к уже "потухшей" реакционной смеси, то возникает повторная вспышка света. Особенно интересные эффекты мы наблюдали, когда биолюминесцентную реакцию проводили не просто в водном растворе, а в мембраноподобном окружении: в мицеллах или липосомах. В этом случае яркость свечения не только возрастала в десятки раз по сравнению с водным раствором, но и не ослабевала в течение десятков минут. Проще говоря, вместо кратковременной вспышки мы получали яркую "лампочку". Эти эксперименты с очевидностью показывают, что в организме светляка люцифераза находится не в водном окружении, а в особых внутриклеточных мембранных структурах. Они-то и обеспечивают наиболее эффективное функционирование фермента и почти 100%-е преобразование энергии ферментативной реакции в световую. .....

Читать очерк дальше: ПОЧЕМУ СВЕЧЕНИЕ БЫВАЕТ РАЗНЫМ?

http://vivovoco.rsl.ru/VV/PAPERS/NATURE/BROVKO.HTM ..